# NextSeq500/550和Miniseq平台进行低多样性文库测序的最佳操作
若希望低[多样性文库](https://support.illumina.com/bulletins/2016/07/what-is-nucleotide-diversity-and-why-is-it-important.html)在NextSeq500/550和Miniseq平台上获得精确和稳定的测序结果，需要精心设计的实验以及良好的生信分析。低多样性文库最常见的例子是基于扩增方法制备的文库，例如16S扩增子文库。这些文库扩增引物结合的位置，即起始位点的DNA序列基本是相同的。单一的位点会导致碱基组成不平衡，以至于碱基组成从一个循环到下一个循环可能会发生剧烈变化。
NextSeq500/550和Miniseq系统使用的是[双通道测序技术](https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/sequencing-technology/2-channel-sbs.html)。因此，确保每个循环中均存在4种DNA碱基是非常重要的，这样分析软件才能正确鉴定DNA簇并精确读取碱基序列。使用低多样性文库时，为了满足这种要求，我们建议在设计实验时，采用以下几种方法保证每个循环的多样性。
* 利用标签区分技术，在测序中加入多个带有标签的来自多种应用的样品。
o 那些来自多样性较高的应用的带有标签的样品，例如人类扩增子测序、富集或者全基因组测序文库，都能够用来增加文库碱基多样性。
o 为了最佳测序结果，可以利用单标签或者双标签技术，将多个样品在同一张Flow Cell上进行测序。
* 在测序中掺入[PhiX control V3文库](https://knowledge.illumina.com/library-preparation/general/library-preparation-general-reference_material-list/000007130)
o 可以加入50% [PhiX](https://www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/cluster-gen-sequencing-reagents/phix-control-v3.html)为初始掺入比例，然后根据一级分析和二级分析的结果，逐步降低PhiX掺入比例。掺入这样的样品能提供每个循环必需的碱基多样性。
* 对于NextSeq和MiniSeq系统，建议测序时簇密度低于平衡库(如PhiX)建议的最佳簇密度的30-40%。
o Miniseq试剂建议平衡文库的原始簇密度最佳范围为170-220 K/mm2。
o NextSeq500/550试剂建议平衡文库的原始簇密度最佳范围为170-220 K/mm2。
本文上述中的这些建议能够使得NextSeq500/550和Miniseq平台进行低多样性文库测序。
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