如何在Illumina测序平台上获得更稳定的簇密度

理想的簇密度对于在MiniSeq，MiSeq，NextSeq 500/550和HiSeq 2500系统上进行高质量的测序是至关重要的。簇密度会显著影响非模式化芯片的测序表现，特别是数据质量与总的数据产量。虽然簇密度较低能够维持较高的数据质量，但是它会导致数据产量较低。另一方面，簇密度过高则会导致测序失败，测序表现较差，Q30值较低，产生测序误差，数据产量较低等。本篇技术文档总结了一些资源以及最佳操作，介绍如何避免簇密度过低或者过高，从而获得更合适的簇密度。

• 文库的质量控制与精确定量至关重要。簇密度不佳最常见的原因是不进行质控与定量。请参考文库定量与质量控制简明指引这篇技术文档中的方法对Illumina文库进行检测。

• 请参考最新的对应仪器指导手册对文库进行稀释和变性：

• Denature and Dilute protocol generator

• 文库变性的最佳操作：

• 在稀释之前，检测储存液的pH，保证2N NaOH储存液的pH>12.5。

• 对于文库变性，每次均配置新鲜稀释的NaOH溶液。

• 为了防止小体积吸液不准确影响最终NaOH浓度，请至少配置1ml新鲜稀释的NaOH溶液。

• 为了获得最佳测序结果，请在文库变性和稀释之前将测序试剂化冻。进一步说明请参考对应仪器的说明书。

• 请参考对应仪器的文库变性和稀释说明书。

• 对于HiSeq2500和MiSeq系列，保证稀释后溶液中NaOH的浓度不超过1mM。如果NaOH的浓度超过1mM会降低模板杂交效率。

• 对于NextSeq500/550和MiniSeq上机文库变性时，使用pH 7.0的200mM Tris-HCl，确保最终溶液中的NaOH被完全水解。这样可以保证即使最终NaOH浓度大于1mM时也不会影响模板杂交（具体操作请参考NextSeq500/550和MiniSeq变性和稀释说明书）。

• 对于复杂结构和高GC含量文库，在文库上机之前进行热变性也能够提高簇密度的稳定性。这种方法对于其它文库为可选方案。

• 当测序文库使用NaOH变性以及使用HT1稀释到最终的上机浓度后，利用恒温仪将稀释好的文库在96°C孵育2分钟。

• 热孵育后，将离心管上下颠倒1-2次混匀文库。

• 将文库快速移至冰浴孵育5分钟。快速冷却的步骤能够帮助文库保持单链形式。

• 立即进行簇生成步骤。

• 考量文库的平均大小。因为簇生成过程中，混合文库中较短文库更容易扩增，而较大文库簇生成的效率会低于较短文库。上机浓度需根据文库的平均大小进行调整，具体可以参考Nextera Library Validation and Cluster Density Optimization技术文档。

• 当进行低多样性文库测序时需要进行特殊考量，保证合适的簇密度和较高的数据质量。对于低多样性文库测序的说明，可以参考对应仪器技术文档：HiSeq，NextSeq 500/550 和 MiniSeq.

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