# 如何在Illumina测序平台上获得更稳定的簇密度

 

理想的簇密度对于在MiniSeq，MiSeq和NextSeq 500/550系统上进行高质量的测序是至关重要的。簇密度会显著影响非模式化芯片的测序表现，特别是数据质量与总的数据产量。虽然簇密度较低能够维持较高的数据质量，但是它会导致数据产量较低。另一方面，簇密度过高则会导致测序失败，测序表现较差，Q30值较低，产生测序误差，数据产量较低等。本篇技术文档总结了一些资源以及最佳操作，介绍如何避免簇密度过低或者过高，从而获得更合适的簇密度。

*  文库的质量控制与精确定量至关重要。簇密度不佳最常见的原因是不进行质控与定量。请参考[**文库定量与质量控制简明指引**](https://knowledge.illumina.com/library-preparation/general/library-preparation-general-reference_material-list/000001247)这篇技术文档中的方法对Illumina文库进行检测。
* 请参考最新的对应仪器指导手册对文库进行稀释和变性：
* [Denature and Dilute protocol generator](https://support-docs.illumina.com/IN/dnd-wizard/Content/dnd/landing.htm)
* 文库变性的最佳操作：
* 在稀释之前，检测储存液的pH，保证2N NaOH储存液的pH>12.5。
* 对于文库变性，每次均配置新鲜稀释的NaOH溶液。
* 为了防止小体积吸液不准确影响最终NaOH浓度，请至少配置1ml新鲜稀释的NaOH溶液。
* 为了获得最佳测序结果，请在文库变性和稀释之前将测序试剂化冻。进一步说明请参考对应仪器的系统指南及公告: [如何解冻和储存测序试剂以获得最佳性能](https://knowledge.illumina.com/instrumentation/general/instrumentation-general-reference_material-list/000001533)。
* 请参考对应仪器的文库变性和稀释说明书。
*  对于MiSeq系列，保证稀释后溶液中NaOH的浓度不超过1mM。如果NaOH的浓度超过1mM会降低模板杂交效率。
* 对于NextSeq500/550和MiniSeq上机文库变性时，使用pH 7.0的200mM Tris-HCl，确保最终溶液中的NaOH被完全水解。这样可以保证即使最终NaOH浓度大于1mM时也不会影响模板杂交（具体操作请参考NextSeq500/550和MiniSeq变性和稀释说明书）。
* 对于复杂结构和高GC含量文库，在文库上机之前进行热变性也能够提高簇密度的稳定性。这种方法对于其它文库为可选方案。
* 当测序文库使用NaOH变性以及使用HT1稀释到最终的上机浓度后，利用恒温仪将稀释好的文库在96°C孵育2分钟。
*  热孵育后，将离心管上下颠倒1-2次混匀文库。
* 将文库快速移至冰浴孵育5分钟。快速冷却的步骤能够帮助文库保持单链形式。
* 立即进行簇生成步骤。
* 考量文库的平均大小。因为簇生成过程中，混合文库中较短文库更容易扩增，而较大文库簇生成的效率会低于较短文库。上机浓度需根据文库的平均大小进行调整，具体可以参考[Nextera文库验证与簇密度优化](http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_nextera_library_validation.pdf)技术文档。
* 当进行[**低多样性文库**](https://knowledge.illumina.com/instrumentation/general/instrumentation-general-reference_material-list/000007399)测序时需要进行特殊考量，保证合适的簇密度和较高的数据质量。对于低多样性文库测序的说明，可以参考对应仪器技术文档：[MiSeq](https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/other/miseq-overclustering-primer-770-2014-038.pdf), [NextSeq 500/550](https://knowledge.illumina.com/instrumentation/general/instrumentation-general-reference_material-list/000007110) 和 [MiniSeq](https://knowledge.illumina.com/instrumentation/general/instrumentation-general-reference_material-list/000007110).

 

\
\
\ <br>

|                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                        |
| :--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------: |
| *For any feedback or questions regarding this article (Illumina Knowledge Article #7398), contact Illumina Technical Support* [*techsupport@illumina.com*](mailto:techsupport@illumina.com?subject=Question%2FFeedback%20Regarding%20Illumina%20Knowledge%20Article%20#000007398%20-%20Instrumentation%20\&body=Dear%20Illumina%20Technical%20Support,%0D%0A%0D%0A)*.* |


---

# Agent Instructions: Querying This Documentation

If you need additional information that is not directly available in this page, you can query the documentation dynamically by asking a question.

Perform an HTTP GET request on the current page URL with the `ask` query parameter:

```
GET https://knowledge.illumina.com/instrumentation/general/instrumentation-general-reference_material-list/000007398.md?ask=<question>
```

The question should be specific, self-contained, and written in natural language.
The response will contain a direct answer to the question and relevant excerpts and sources from the documentation.

Use this mechanism when the answer is not explicitly present in the current page, you need clarification or additional context, or you want to retrieve related documentation sections.