在Illumina平台进行低多样性文库测序时，应该掺入多少PhiX？
进行低多样性文库测序时，碱基组成不平衡会对簇模板的创建（非固定模板位置的Flow Cells）、Q30分值以及数据产出量产生负面影响。
查阅Illumina技术文档 “什么是核苷酸多样性，它为什么十分重要？”，可以获得更多关于碱基多样性的信息，并了解它在Illumina测序平台的重要性。
对于低多样性文库，Illumina建议测序时在低多样性文库中掺入一定量的V3版本的PhiX对照文库（FC-110-3001，通常简称为“PhiX”）来增加碱基平衡性。PhiX文库的碱基组成比较多样化（45% GC和55% AT），所以它能够帮助平衡低多样性文库在每个循环测序时所缺少的荧光信号，进而有助于簇模板的创建正确性并提高整个测序的质量。
关于PhiX对照文库更多的信息，请参考技术文档“PhiX Control v3文库是什么，它在Illumina下一代测序中起到什么作用？”
下面表格列举了在不同测序平台使用特定控制软件进行低多样性文库测序时，Illumina建议掺入的V3版本的PhiX对照文库的比例。
iSeq 100
Minimum 5%
MiniSeq
10-50%*
MiSeq (MCS 2.2 or higher)
Minimum 5%
NextSeq 500/550
10-50%*
NextSeq 1000/2000
10-50%**
HiSeq 1000/1500/2000/2500 (HCS 2.2.38 or higher)
Minimum 5%
HiSeq 3000/4000 (HCS 3.3.76 or lower)
10-50%*
HiSeq 3000/4000 (HCS 3.4.0 or higher)
5-20%*
NovaSeq 6000
Minimum 5%
† 要获得上面表格中所描述的最终被比对上的PhiX比例（PhiX aligned (%)），实际掺入的PhiX比例需要根据PhiX和样本文库成簇效率的差异进行调整。例如，如果上样文库成簇效率比PhiX更高，那么需要掺入的PhiX比例就要比建议值更高。如果您需要了解某种特定文库和测序平台的相关信息，可以发邮件到chinasupport@illumina去获得更多技术支持。
*PhiX掺入比例可以基于实验结果进一步调整。Illumina建议开始时掺入较高的PhiX比例，然后根据实验结果调整比例。
**当使用NextSeq 1000/2000 P1 and P2 600 cycle试剂盒对低多样性文库进行测序时，需要最终被比对上的PhiX比例为至少32%，才能获得最佳测序表现。考虑到最终被比对上的PhiX比例的变化，我们建议掺入40%的PhiX。后期可以根据低多样文库的特点进行优化，逐步调整掺入PhiX的百分比。
可能会经常问到的问题：
1. PhiX对照文库能否增加低多样性标签的碱基平衡性？ 不能，PhiX对照文库不含有标签信息，不能够平衡标签的测序信号。
2. 测序低多样性文库时，有没有其它问题需要考虑？
根据不同平台和化学反应版本，降低文库上机浓度，使簇密度降低最佳簇密度范围的30%-40%。最佳的上机浓度需要根据经验进行调整。更多信息，可以参考：
Cluster density guidelines for Illumina sequencing platforms
Optimizing Cluster Density on Illumina Sequencing Systems
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