# NextSeq 500/550和MiniSeq测序系统上index混合的指导方针 在NextSeq500/550 和MiniSeq测序系统上对混合文库进行index测序时，非常重要的一点是要选择合适的index组合，否则可能会因为在读index时簇定位失败而导致index测序失败。本篇bulletin将针对NextSeq 和MiniSeq系统提供样本混合方针。 **双通道测序** NextSeq 500/550和MiniSeq 测序系统只需要2张图片就可以区分4种碱基：一张图片来自红光通道，另一张图片来自绿光通道。不同于每种碱基各带一种单独的荧光标记的四通道测序，双通道测序使用两种荧光染料，C碱基标记红色，T碱基标记绿色，A碱基同时标记红色和绿色，G碱基没有荧光标记。 ![](https://supportassets.illumina.com/content/dam/illumina-support/images/bulletins/z5.png) 图1：双通道SBS荧光成像（假彩色图片仅是效果图）。为了提高4种DNA碱基的检测速度，MiniSeq和NextSeq500/550只用了2个图像分别捕捉红色和绿色波段的信号。仅在红色或绿色图像检测到的cluster分别被转译为C和T碱基。同时在红色图像和绿色图像被检测到的cluster被转译为A碱基，在两张图片中都没有检测到信号的cluster将被认为是G碱基。 **Index的考量** * Index reads中前两个循环必须至少有一个碱基不是G。如果index read前面两个碱基都是G，就会由于没有荧光信号导致cluster定位失败，所以Index的前两个循环中必须有一个碱基有信号才能确保index的正常拆分。 * 选择index进行组合时，每个循环都至少有一个通道有信号，最好是两个通道都有信号。 * 红色通道对应A或者C碱基 * 绿色通道对应A或者T碱基 这样碱基读取的过程才能确保数据分析的精确。 **Index组合的例子：**\ \ ![](https://761066130-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FGM9W2DuBTgEXv1ClCm8H%2Fuploads%2Fgit-blob-b09a54a9308b0579f0121839b8a2f544fa04d066%2Fimage1.jpg?alt=media\&token=4f444cb4-7dfd-4ef4-a265-0ace15ed3d6f)\ 理想的index组合：每个循环需要两个通道都有信号。\ ![](https://761066130-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FGM9W2DuBTgEXv1ClCm8H%2Fuploads%2Fgit-blob-8f69e2b8ca13f85b54e1b50e910623000aa18c30%2Fimage2.jpg?alt=media)\ 可接受的index组合：只有一个通道有信号，但是仍然有足够的信号进行测序。\ ![](https://761066130-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FGM9W2DuBTgEXv1ClCm8H%2Fuploads%2Fgit-blob-c14100611084f8ea225b3cf23720c6f823a14426%2Fimage3.jpg?alt=media)\ 不好的index组合：index read前两个碱基都是G，没有信号产生，导致cluster定位失败。 **✔**= 两个通道均有信号。注意，A碱基在红色和绿色两个通道中均有荧光。 **✔**= 只一个通道有信号，可接受的组合。 **✖**= 两个通道中均没有信号。 点击[这里](https://sapac.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/sequencing-technology/2-channel-sbs.html?langsel=/my/) 获得更多双通道测序的信息。 \ \ \
| | | :--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------: | | *For any feedback or questions regarding this article (Illumina Knowledge Article #7297), contact Illumina Technical Support* [*techsupport@illumina.com*](mailto:techsupport@illumina.com?subject=Question%2FFeedback%20Regarding%20Illumina%20Knowledge%20Article%20#000007297%20-%20Instrumentation%20\&body=Dear%20Illumina%20Technical%20Support,%0D%0A%0D%0A)*.* |