将定制引物掺入到Illumina测序引物中

在Illumina测序平台上利用定制引物对制备好的文库进行测序时，需要对其进行优化，以保证测序正常进行。当定制样本与PhiX或其它Illumina标准文库混合测序时，需要将定制引物与Illumina引物合并，或者将定制引物掺入到Illumina引物中。Illumina无法保证定制引物是否作用或者兼容，需要客户自己验证这些引物是可以在特定平台上进行测序。当使用定制测序引物时，最关键是需要了解基于平台推荐的装载浓度，总的体积，装载位置以及 引物退火温度。该技术文档为如何将定制引物掺入到Illumina测序引物中提供了相关信息。

iSeq 100 | MiniSeq | MiSeq | NextSeq 500/550 | NextSeq 1000/2000 | HiSeq 1000/1500/2000/2500 | HiSeq 3000/4000 | NovaSeq 6000

将定制引物掺入到Illumina引物中

• 下面这些表格分别提供了针对不同平台定制引物的试剂槽位置，总体积以及终浓度。

• 基于试剂槽中定制引物的终浓度，计算加入到Illumina引物试剂槽位置的定制引物体积。*

• 掺入定制引物后，将吸液器体积调至总体积的一半，用吸液器缓慢上下吹打溶液5次，使之充分混匀。**

• 对于MiSeq、MiniSeq、NextSeq500/550和NovaSeq6000平台，在sample sheet或者程序设置时，不要勾选 “custom primer” 选项。

*可以用(C1)(V1) = (C2)(V2)等式计算需要掺入多少定制引物到对应孔里:

C1=您定制引物的浓度（当使用高浓度引物储存液时，例如100uM，相对于最终的体积，额外增加的体积非常小，可以忽略）

V1=掺入定制引物的体积

C2=参考下面表格中推荐的定制引物的终浓度

V2=参考下面表格中Illumina引物的总体积

例如: (100uM * V1) = (0.5uM * 680uL)

V1 = 3.4 µL

**MiSeq、NextSeq和MiniSeq试剂槽：为了提高Illumina测序引物体积测定以及定制引物掺入和混匀的成功率，建议使用较细的枪头或者较大体积的低浓度定制引物。

重要说明: 以下指导资料是基于目前引物的体积。为了确保准确性，在进行操作前，请先测定试剂槽中引物的总体积。

iSeq 100

随着iSeq 控制软件3.0的发布，现在iSeq100也可以用定制引物测序。由于iSeq试剂卡盒的构造原因，我们无法直接将定制引物提前加入到Illumina 引物中。

不同于将定制引物直接混入试剂卡盒的引物孔中，iSeq 100定制引物测序需要用到NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒，并且该试剂盒配置是兼容iSeq 100的。定制引物需要先添加到适当Illumina引物中，然后按照iSeq 100定制引物流程添加到试剂卡盒中。对于NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒的说明和货号，请查阅 NextSeq 1000/2000 Custom Primers Guide.

重要说明：NextSeq 1000/2000定制引物指南提供了针对NextSeq 1000/2000的引物添加说明。对于iSeq100定制引物的添加请参阅以下说明。

Kit version	Illumina Primer (name)	Cartridge Position	Total Volume (µL)	Custom primer final concentration (µM)
i1 v2	Read 1 (HP21)	NA	140	0.3
Index 1 (i7) (BP14)	NA	140	0.6
Index 2 (i5) (BP14)	NA	140	0.6
Read 2 (HP21)	NA	140	0.3

MiniSeq

由于MiniSeq上独特的双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考相应文档。

Kit version	Illumina Primer (name)	Cartridge Position	Total Volume (µL)	Custom primer final concentration (µM)
Rapid Run 100 Cycles	Read 1 (BP10)	24	590	0.3
Read 2 (BP11)	25	530	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	28	740	0.3
High Output 75 Cycles	Read 1 (BP10)	24	550	0.3
Read 2 (BP11)	25	610	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	28	820	0.3
High Output 150 Cycles	Read 1 (BP10)	24	550	0.3
Read 2 (BP11)	25	610	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	28	857	0.3
High Output 300 Cycles	Read 1 (BP10)	24	550	0.3
Read 2 (BP11)	25	610	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	28	820	0.3
Mid Output 300 Cycles	Read 1 (BP10)	24	550	0.3
Read 2 (BP11)	25	610	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	28	820	0.3

MiSeq

Kit version	Illumina Primer (name)	Cartridge Position	Total Volume (µL)	Custom primer final concentration (µM)
v2 and v3	Read 1 (HP10)	12	680	0.5
Index 1 (i7) (HP12)*	13	680	0.5
Read 2 (HP11)	14	680	0.5

* 由于模板使用流动槽(Flowcell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。

NextSeq 500/550

由于NextSeq上独特的双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考相应文档 。

Kit version	Illumina Primer (name)	Cartridge Position	Total Volume (mL)	Custom primer final concentration (µM)
High Output 75 cycles	Read 1 (BP10)	20	1.72	0.3
Read 2 (BP11)	21	1.98	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	22	2.83	0.3
High Output 150 Cycles	Read 1 (BP10)	20	1.73	0.3
Read 2 (BP11)	21	1.98	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	22	2.83	0.3
High Output 300 Cycles	Read 1 (BP10)	20	1.73	0.3
Read 2 (BP11)	21	1.98	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	22	2.83	0.3
Mid Output 150 Cycles	Read 1 (BP10)	20	1.34	0.3
Read 2 (BP11)	21	1.51	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	22	2.09	0.3
Mid Output 300 Cycles	Read 1 (BP10)	20	1.33	0.3
Read 2 (BP11)	21	1.52	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)	22	2.09	0.3

NextSeq 1000/2000

由于NextSeq 1000/2000试剂卡盒的构造原因，无法直接将定制引物加入到Illumina测序引物中。

如果在测序文库中有Phix需要用到Illumina测序引物，就需要用到NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒。具体请参阅NextSeq 1000/2000 Custom Primers Guide。

HiSeq 1000/1500/2000/2500

Kit version	Illumina Primer (name)	Position	Total Volume (mL)	Custom primer final concentration (µM)
High Output v4	Read 1 (HP10)	cBot plate - Row 2	0.3 per tube	0.5
Index 1 (i7) (HP12)	PE rack - 17	2.5	0.5
Index 2 (i5) (HP9) on a single read run*	PE rack - 16	2.5	0.5
Read 2 (HP11)	PE rack - 16	2.5	0.5
High Output v3	Read 1 (HP6)	cBot plate - Row 11	0.3 per tube	0.5
Index 1 (i7) (HP8 or HP12)	PE rack - 17	3.15	0.5
Index 2 (i5) (HP9) on a single read run*	PE rack - 16	3.15	0.5
Read 2 (HP7 or HP11)	PE rack - 16	3.15	0.5
Rapid Run v2	Read 1 (HP10)	PE rack - 18	1.93	0.5
Index 1 (i7) (HP12)	PE rack - 17	1.93	0.5
Index 2 (i5) (HP9) on a single read run*	PE rack - 16	1.93	0.5
Read 2 (HP11)	PE rack - 16	1.93	0.5

* 由于模板使用流动槽(Flow Cell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。

HiSeq 3000/4000

Kit version	Illumina Primer (name)	Position	Total Volume (mL)	Custom primer final concentration (µM)
High Output	Read 1 (HP10)	cBot plate - Row 11	0.39 per tube	0.5
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (HP14)	PE rack - 17	4.31	0.5
Read 2 (HP11)	PE rack - 16	2.64	0.5

NovaSeq 6000

由于NovaSeq上的引物设计和双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考文档。

NovaSeq 6000 v1.0 Consumables

Kit version	Illumina Primer (name)	Cartridge Position	Total Volume (mL)	Custom primer final concentration (µM)
SP 100/200/300/500 cycles	Read 1 (BP10)	24	4	0.3
Index 1 (i7) (BP14)*	23	5	0.3
Read 2 (BP11)	13	2	0.3
S1 and S2 100/200/300 cycles	Read 1 (BP10)	24	4	0.3
Index 1 (i7) (BP14)*	23	5	0.3
Read 2 (BP11)	13	2	0.3
S4 200/300 cycles	Read 1 (BP10)	24	7.3	0.3
Index 1 (i7) (BP14)*	23	5	0.3
Read 2 (BP11)	13	3.5	0.3

*由于模板使用流动槽(Flow Cell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。

NovaSeq 6000 v1.5 Consumables

Kit version	Illumina Primer (name)	Cartridge Position	Total Volume (mL)	Custom primer final concentration (µM)
SP 100/200/300/500 cycles	Read 1 (VP10)	24	4	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14)	23	5	0.3
Read 2 (VP11)	13	2	0.3
S1 and S2 100/200/300 cycles	Read 1 (VP10)	24	4	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14)	23	5	0.3
Read 2 (VP11)	13	2	0.3
S4 200/300 cycles	Read 1 (VP10)	24	7.3	0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14)	23	5	0.3
Read 2 (VP11)	13	3.5	0.3

使用定制引物替代Illumina引物

如果仅需要定制引物，可以用定制引物替代Illumina引物。当仅使用定制引物时，设置运行程序的说明，可以参考以下文档：

• MiniSeq System Custom Primers Guide

• MiSeq System Custom Primers Guide

• NextSeq 500/550 System Custom Primers Guide

• HiSeq System Custom Primers Guide

• NovaSeq Series Custom Primers Guide

• iSeq 100 Custom Primers Guide

关于各个平台标签测序的更多信息，请参考文档Indexed Sequencing Overview Guide.

For any feedback or questions regarding this article (Illumina Knowledge Article #7451), contact Illumina Technical Support [e-mail].