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将定制引物掺入到Illumina测序引物中

在Illumina测序平台上利用定制引物对制备好的文库进行测序时，需要对其进行优化，以保证测序正常进行。当定制样本与PhiX或其它Illumina标准文库混合测序时，需要将定制引物与Illumina引物合并，或者将定制引物掺入到Illumina引物中。Illumina无法保证定制引物是否作用或者兼容，需要客户自己验证这些引物是可以在特定平台上进行测序。当使用定制测序引物时，最关键是需要了解基于平台推荐的装载浓度，总的体积，装载位置以及 引物退火温度arrow-up-right。该技术文档为如何将定制引物掺入到Illumina测序引物中提供了相关信息。

将定制引物掺入到Illumina引物中

  • 下面这些表格分别提供了针对不同平台定制引物的试剂槽位置，总体积以及终浓度。

  • 基于试剂槽中定制引物的终浓度，计算加入到Illumina引物试剂槽位置的定制引物体积*。

  • 掺入定制引物后，将吸液器体积调至总体积的一半，用吸液器缓慢上下吹打溶液5次，使之充分混匀**。

  • 对于MiSeq、MiniSeq、NextSeq500/550和NovaSeq6000平台，在sample sheet或者程序设置时，不要勾选 “custom primer” 选项。

*可以用(C1)(V1) = (C2)(V2)等式计算需要掺入多少定制引物到对应孔里:

C1=您定制引物的浓度（当使用高浓度引物储存液时，例如100uM，相对于最终的体积，额外增加的体积非常小，可以忽略）

V1=掺入定制引物的体积

C2=参考下面表格中推荐的定制引物的终浓度

V2=参考下面表格中Illumina引物的总体积

例如: (100uM * V1) = (0.5uM * 680uL)

V1 = 3.4 µL

**MiSeq、NextSeq和MiniSeq试剂槽：为了提高Illumina测序引物体积测定以及定制引物掺入和混匀的成功率，建议使用较细的枪头或者较大体积的低浓度定制引物。

重要说明: 以下指导资料是基于目前引物的体积。为了确保准确性，在进行操作前，请先测定试剂槽中引物的总体积。

iSeq 100

随着iSeq 控制软件3.0的发布，现在iSeq100也可以用定制引物测序。由于iSeq试剂卡盒的构造原因，我们无法直接将定制引物提前加入到Illumina 引物中。

不同于将定制引物直接混入试剂卡盒的引物孔中，iSeq 100定制引物测序需要用到NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒，并且该试剂盒配置是兼容iSeq 100的。定制引物需要先添加到适当Illumina引物中，然后按照iSeq 100定制引物流程添加到试剂卡盒中。对于NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒的说明和货号，请查阅 NextSeq 1000/2000 Custom Primers Guidearrow-up-right.

重要说明：NextSeq 1000/2000定制引物指南提供了针对NextSeq 1000/2000的引物添加说明。对于iSeq100定制引物的添加请参阅以下说明。

Kit version

Illumina Primer (name)

Cartridge Position

Total Volume (µL)

Custom primer final concentration (µM)

i1 v2

Read 1 (HP21)

NA

140

0.3

Index 1 (i7) (BP14)

NA

140

0.6

Index 2 (i5) (BP14)

NA

140

0.6

Read 2 (HP21)

NA

140

0.3

MiniSeq

由于MiniSeq上独特的双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考相应文档arrow-up-right。

Kit version

Illumina Primer (name)

Cartridge Position

Total Volume (µL)

Custom primer final concentration (µM)

Rapid Run 100 Cycles

Read 1 (BP10)

24

590

0.3

Read 2 (BP11)

25

530

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

28

740

0.3

High Output 75 Cycles

Read 1 (BP10)

24

550

0.3

Read 2 (BP11)

25

610

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

28

820

0.3

High Output 150 Cycles

Read 1 (BP10)

24

550

0.3

Read 2 (BP11)

25

610

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

28

857

0.3

High Output 300 Cycles

Read 1 (BP10)

24

550

0.3

Read 2 (BP11)

25

610

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

28

820

0.3

Mid Output 300 Cycles

Read 1 (BP10)

24

550

0.3

Read 2 (BP11)

25

610

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

28

820

0.3

MiSeq

Kit version

Illumina Primer (name)

Cartridge Position

Total Volume (µL)

Custom primer final concentration (µM)

v2 and v3

Read 1 (HP10)

12

680

0.5

Index 1 (i7) (HP12)*

13

680

0.5

Read 2 (HP11)

14

680

0.5

* 由于模板使用流动槽(Flowcell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。

MiSeq i100 Series

对于Miseq i100测序的定制引物添加请参考 Spiking custom primers into the Illumina sequencing primers for MiSeq i100 Seriesarrow-up-right。

NextSeq 500/550

由于NextSeq上独特的双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考相应文档 arrow-up-right。

Kit version

Illumina Primer (name)

Cartridge Position

Total Volume (mL)

Custom primer final concentration (µM)

High Output 75 cycles

Read 1 (BP10)

20

1.72

0.3

Read 2 (BP11)

21

1.98

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

22

2.83

0.3

High Output 150 Cycles

Read 1 (BP10)

20

1.73

0.3

Read 2 (BP11)

21

1.98

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

22

2.83

0.3

High Output 300 Cycles

Read 1 (BP10)

20

1.73

0.3

Read 2 (BP11)

21

1.98

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

22

2.83

0.3

Mid Output 150 Cycles

Read 1 (BP10)

20

1.34

0.3

Read 2 (BP11)

21

1.51

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

22

2.09

0.3

Mid Output 300 Cycles

Read 1 (BP10)

20

1.33

0.3

Read 2 (BP11)

21

1.52

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)

22

2.09

0.3

NextSeq 1000/2000

由于NextSeq 1000/2000试剂卡盒的构造原因，无法直接将定制引物加入到Illumina测序引物中。

如果在测序文库中有Phix需要用到Illumina测序引物，就需要用到NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒。具体请参阅NextSeq 1000/2000 Custom Primers Guidearrow-up-right。

NovaSeq 6000 v1.5 Consumables

由于NovaSeq 6000上的引物设计和双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考文档arrow-up-right。

Kit version

Illumina Primer (name)

Cartridge Position

Total Volume (mL)

Custom primer final concentration (µM)

SP 100/200/300/500 cycles

Read 1 (VP10)

24

4

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14)

23

5

0.3

Read 2 (VP11)

13

2

0.3

S1 and S2 100/200/300 cycles

Read 1 (VP10)

24

4

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14)

23

5

0.3

Read 2 (VP11)

13

2

0.3

S4 200/300 cycles

Read 1 (VP10)

24

7.3

0.3

Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14)

23

5

0.3

Read 2 (VP11)

13

3.5

0.3

NovaSeq X/X Plus

NovaSeq X/X Plus 采用了两种引物溶液，它们分别包含了Read1 和 Read2以及Index1和Index2 所需的引物。如果仅为特定的Reads需要定制引物测序，请将高浓度的定制引物掺入到需要定制引物的相应孔中。在掺入定制引物时，无需更改运行设置，也无需使用定制配方（custom recipe）。

该表格列出了孔位信息、Illumina 引物体积以及建议添加的定制引物（CP）体积（单位为微升，µL），假设所使用的定制引物储备液的初始浓度为 100 微摩尔（µM）。

使用定制引物替代Illumina引物

如果仅需要定制引物，可以用定制引物替代Illumina引物。当仅使用定制引物时，设置运行程序的说明，可以参考以下文档：

关于各个平台标签测序的更多信息，请参考文档Indexed Sequencing Overview Guidearrow-up-right.

For any feedback or questions regarding this article (Illumina Knowledge Article #7451), contact Illumina Technical Support [email protected]envelope.

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