将定制引物掺入到Illumina测序引物中
在Illumina测序平台上利用定制引物对制备好的文库进行测序时，需要对其进行优化，以保证测序正常进行。当定制样本与PhiX或其它Illumina标准文库混合测序时，需要将定制引物与Illumina引物合并，或者将定制引物掺入到Illumina引物中。Illumina无法保证定制引物是否作用或者兼容，需要客户自己验证这些引物是可以在特定平台上进行测序。当使用定制测序引物时，最关键是需要了解基于平台推荐的装载浓度，总的体积，装载位置以及 引物退火温度。该技术文档为如何将定制引物掺入到Illumina测序引物中提供了相关信息。
iSeq 100 | MiniSeq | MiSeq | NextSeq 500/550 | NextSeq 1000/2000 | HiSeq 1000/1500/2000/2500 | HiSeq 3000/4000 | NovaSeq 6000
将定制引物掺入到Illumina引物中
下面这些表格分别提供了针对不同平台定制引物的试剂槽位置，总体积以及终浓度。
基于试剂槽中定制引物的终浓度，计算加入到Illumina引物试剂槽位置的定制引物体积。*
掺入定制引物后，将吸液器体积调至总体积的一半，用吸液器缓慢上下吹打溶液5次，使之充分混匀。**
对于MiSeq、MiniSeq、NextSeq500/550和NovaSeq6000平台，在sample sheet或者程序设置时，不要勾选 “custom primer” 选项。
*可以用(C1)(V1) = (C2)(V2)等式计算需要掺入多少定制引物到对应孔里:
C1=您定制引物的浓度（当使用高浓度引物储存液时，例如100uM，相对于最终的体积，额外增加的体积非常小，可以忽略）
V1=掺入定制引物的体积
C2=参考下面表格中推荐的定制引物的终浓度
V2=参考下面表格中Illumina引物的总体积
例如: (100uM * V1) = (0.5uM * 680uL)
V1 = 3.4 µL
**MiSeq、NextSeq和MiniSeq试剂槽：为了提高Illumina测序引物体积测定以及定制引物掺入和混匀的成功率，建议使用较细的枪头或者较大体积的低浓度定制引物。
重要说明: 以下指导资料是基于目前引物的体积。为了确保准确性，在进行操作前，请先测定试剂槽中引物的总体积。
iSeq 100
随着iSeq 控制软件3.0的发布，现在iSeq100也可以用定制引物测序。由于iSeq试剂卡盒的构造原因，我们无法直接将定制引物提前加入到Illumina 引物中。
不同于将定制引物直接混入试剂卡盒的引物孔中，iSeq 100定制引物测序需要用到NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒，并且该试剂盒配置是兼容iSeq 100的。定制引物需要先添加到适当Illumina引物中，然后按照iSeq 100定制引物流程添加到试剂卡盒中。对于NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒的说明和货号，请查阅 NextSeq 1000/2000 Custom Primers Guide.
重要说明：NextSeq 1000/2000定制引物指南提供了针对NextSeq 1000/2000的引物添加说明。对于iSeq100定制引物的添加请参阅以下说明。
Kit version
Illumina Primer (name)
Cartridge Position
Total Volume (µL)
Custom primer final concentration (µM)
i1 v2
Read 1 (HP21)
NA
140
0.3
Index 1 (i7) (BP14)
NA
140
0.6
Index 2 (i5) (BP14)
NA
140
0.6
Read 2 (HP21)
NA
140
0.3
MiniSeq
由于MiniSeq上独特的双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考相应文档。
Kit version
Illumina Primer (name)
Cartridge Position
Total Volume (µL)
Custom primer final concentration (µM)
Rapid Run 100 Cycles
Read 1 (BP10)
24
590
0.3
Read 2 (BP11)
25
530
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
28
740
0.3
High Output 75 Cycles
Read 1 (BP10)
24
550
0.3
Read 2 (BP11)
25
610
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
28
820
0.3
High Output 150 Cycles
Read 1 (BP10)
24
550
0.3
Read 2 (BP11)
25
610
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
28
857
0.3
High Output 300 Cycles
Read 1 (BP10)
24
550
0.3
Read 2 (BP11)
25
610
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
28
820
0.3
Mid Output 300 Cycles
Read 1 (BP10)
24
550
0.3
Read 2 (BP11)
25
610
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
28
820
0.3
MiSeq
Kit version
Illumina Primer (name)
Cartridge Position
Total Volume (µL)
Custom primer final concentration (µM)
v2 and v3
Read 1 (HP10)
12
680
0.5
Index 1 (i7) (HP12)*
13
680
0.5
Read 2 (HP11)
14
680
0.5
* 由于模板使用流动槽(Flowcell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。
NextSeq 500/550
由于NextSeq上独特的双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考相应文档 。
Kit version
Illumina Primer (name)
Cartridge Position
Total Volume (mL)
Custom primer final concentration (µM)
High Output 75 cycles
Read 1 (BP10)
20
1.72
0.3
Read 2 (BP11)
21
1.98
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
22
2.83
0.3
High Output 150 Cycles
Read 1 (BP10)
20
1.73
0.3
Read 2 (BP11)
21
1.98
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
22
2.83
0.3
High Output 300 Cycles
Read 1 (BP10)
20
1.73
0.3
Read 2 (BP11)
21
1.98
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
22
2.83
0.3
Mid Output 150 Cycles
Read 1 (BP10)
20
1.34
0.3
Read 2 (BP11)
21
1.51
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
22
2.09
0.3
Mid Output 300 Cycles
Read 1 (BP10)
20
1.33
0.3
Read 2 (BP11)
21
1.52
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14)
22
2.09
0.3
NextSeq 1000/2000
由于NextSeq 1000/2000试剂卡盒的构造原因，无法直接将定制引物加入到Illumina测序引物中。
如果在测序文库中有Phix需要用到Illumina测序引物，就需要用到NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒。具体请参阅NextSeq 1000/2000 Custom Primers Guide。
HiSeq 1000/1500/2000/2500
Kit version
Illumina Primer (name)
Position
Total Volume (mL)
Custom primer final concentration (µM)
High Output v4
Read 1 (HP10)
cBot plate - Row 2
0.3 per tube
0.5
Index 1 (i7) (HP12)
PE rack - 17
2.5
0.5
Index 2 (i5) (HP9) on a single read run*
PE rack - 16
2.5
0.5
Read 2 (HP11)
PE rack - 16
2.5
0.5
High Output v3
Read 1 (HP6)
cBot plate - Row 11
0.3 per tube
0.5
Index 1 (i7) (HP8 or HP12)
PE rack - 17
3.15
0.5
Index 2 (i5) (HP9) on a single read run*
PE rack - 16
3.15
0.5
Read 2 (HP7 or HP11)
PE rack - 16
3.15
0.5
Rapid Run v2
Read 1 (HP10)
PE rack - 18
1.93
0.5
Index 1 (i7) (HP12)
PE rack - 17
1.93
0.5
Index 2 (i5) (HP9) on a single read run*
PE rack - 16
1.93
0.5
Read 2 (HP11)
PE rack - 16
1.93
0.5
* 由于模板使用流动槽(Flow Cell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。
HiSeq 3000/4000
Kit version
Illumina Primer (name)
Position
Total Volume (mL)
Custom primer final concentration (µM)
High Output
Read 1 (HP10)
cBot plate - Row 11
0.39 per tube
0.5
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (HP14)
PE rack - 17
4.31
0.5
Read 2 (HP11)
PE rack - 16
2.64
0.5
NovaSeq 6000
由于NovaSeq上的引物设计和双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考文档。
NovaSeq 6000 v1.0 Consumables
Kit version
Illumina Primer (name)
Cartridge Position
Total Volume (mL)
Custom primer final concentration (µM)
SP 100/200/300/500 cycles
Read 1 (BP10)
24
4
0.3
Index 1 (i7) (BP14)*
23
5
0.3
Read 2 (BP11)
13
2
0.3
S1 and S2 100/200/300 cycles
Read 1 (BP10)
24
4
0.3
Index 1 (i7) (BP14)*
23
5
0.3
Read 2 (BP11)
13
2
0.3
S4 200/300 cycles
Read 1 (BP10)
24
7.3
0.3
Index 1 (i7) (BP14)*
23
5
0.3
Read 2 (BP11)
13
3.5
0.3
*由于模板使用流动槽(Flow Cell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。
NovaSeq 6000 v1.5 Consumables
Kit version
Illumina Primer (name)
Cartridge Position
Total Volume (mL)
Custom primer final concentration (µM)
SP 100/200/300/500 cycles
Read 1 (VP10)
24
4
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14)
23
5
0.3
Read 2 (VP11)
13
2
0.3
S1 and S2 100/200/300 cycles
Read 1 (VP10)
24
4
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14)
23
5
0.3
Read 2 (VP11)
13
2
0.3
S4 200/300 cycles
Read 1 (VP10)
24
7.3
0.3
Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14)
23
5
0.3
Read 2 (VP11)
13
3.5
0.3
使用定制引物替代Illumina引物
如果仅需要定制引物，可以用定制引物替代Illumina引物。当仅使用定制引物时，设置运行程序的说明，可以参考以下文档：
关于各个平台标签测序的更多信息，请参考文档Indexed Sequencing Overview Guide.
For any feedback or questions regarding this article (Illumina Knowledge Article #7451), contact Illumina Technical Support techsupport@illumina.com.
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