# 手动文库浓度标准化最佳操作

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文库浓度标准化是将多个文库按照体积合并之前将不同浓度的文库稀释至相同浓度的过程，以确保同一合并文库中所有样品的测序数据量分布均匀。 标准化的最佳操作适用于Illumina所有需要手动标准化的文库制备。 标准化步骤为：

1\. 确定文库长度

2\. 定量文库

3\. 规划稀释度

4\. 合并标准化后的文库

&#x20;

*在某些文库制备试剂盒中，例如Nextera XT和Illumina DNA Prep, (M) Tagmentation (更名前为Nextera DNA Flex)，提供了磁珠标准化方法。 若使用该方法，则不需要进行手动标准化。 但是，若用于Illumina DNA Prep, (M) Tagmentation建库试剂盒的起始DNA样本量低于100 ng或Nextera XT建库试剂盒得到的最终文库产量低于10–15 nM时，磁珠标准化将不再适用。 在这种情况下，手动标准化则成为必要手段。*

注意：Illumina DNA Prep, (M) Tagmentation 和 Nextera XT工作流程中磁珠标准化的化学方法不同，因此测序前的文库变性和稀释方法也不同。有关的更多信息，请联系Illumina大中华技术支持（<chinasupport@illumina.com>）。

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**确定文库长度**

通过在生物分析仪(Bioanalyzer)或片段分析仪(Fragment Analyzer)验证文库大小。 此步骤还可以查看文库可能存在的问题，例如接头二聚体或预期外的文库长度

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**定量文库**

使用文库制备说明书中指定的推荐定量方法进行文库的定量，不同文库推荐的定量方法汇总请查看[文库定量与质量控制简明指引](https://sapac.support.illumina.com/content/illumina-support/us/en/bulletins/2016/05/chinese-library-quantification-and-quality-control-quick-reference-guide.html)小贴士。

根据生物分析仪或片段分析仪上显示的文库平均长度，参照[双链DNA文库浓度的计算：从质量浓度(ng/µl)转化为摩尔浓度(nM)的换算公式](https://sapac.support.illumina.com/content/illumina-support/us/en/bulletins/2017/07/chinese-converting-ng-ul-to-nm-when-calculating-dsdna-library-co.html)小贴士中给出的换算公式进行浓度单位ng/µl到nM的浓度换算。

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**规划稀释度**

在此步骤中进行浓度标准化。 请使用分子生物级水或10 mM Tris-HCl pH 8.5进行文库稀释。[文库混合计算器](https://support.illumina.com/help/pooling-calculator/pooling-calculator.htm)是计算文库稀释度的小工具，可以对具有相同或不同浓度的文库进行计算。

1\.   确定通用浓度以稀释文库用于后续应用。 对于大多数Illumina测序平台，每个文库2-4 nM是变性和稀释说明书中的首选起始浓度。 如需获取更多信息请查阅相应的仪器用户手册

2\.   按照下述公式计算文库的稀释度

&#x20;       **(C1)(V1)=(C2)(V2)**

&#x20;   C1=起始浓度；V1=将要被稀释的原液体积；C2=终浓度；V2=稀释后的体积

为了获得最均匀地样品数据量分布和最可靠的簇密度，请确保所有移液体积至少为2 µl。 移液量少于2 µl会引入明显的浓度误差， 请根据需要调整计算以确保使用适当的体积。 对于高浓度的文库，请使用梯度稀释法。

例如，以下计算演示了如何将3个文库（起始浓度分别为15 nM，20 nM和50 nM的不同浓度）稀释为终浓度4 nM，终体积为15 µl。 &#x20;

| 起始浓度    | <p>存储液DNA体积<br>( 4 nM 终浓度)</p> | <p>稀释后体积<br>(15 ul 终体积)</p> |
| ------- | ------------------------------ | --------------------------- |
| 15 nM   | 4 ul                           | 11 ul                       |
| 20 nM   | 3 ul                           | 12 ul                       |
| 50 nM\* | 1.2 ul                         | 13.8 ul                     |

\* 示例中50 nM文库仅使用了1.2 µl原始DNA进而稀释至4 nM。 为了获得最准确的结果，有必要进行20 nM的中间稀释以达到2 µl移液的体积，见下表

| 中间稀释  | 最终的稀释                                           |                             |                                      |                             |
| ----- | ----------------------------------------------- | --------------------------- | ------------------------------------ | --------------------------- |
| 起始浓度  | <p>存储液DNA体积<br>(20 nM concentration中间稀释的浓度)</p> | <p>稀释后体积<br>(15 ul 终体积)</p> | <p>中间稀释的体积<br>20 nM DNA(4 nM终浓度)</p> | <p>稀释后体积<br>(15 ul 终体积)</p> |
| 50 nM | 6 ul                                            | 9 ul                        | 3 ul                                 | 12 ul                       |

3\.   根据上述计算进行稀释，文库浓度实现了标准化

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**合并标准化后文库**

合并文库池：将等体积的每个标准化文库合并到一个微量离心管中，并轻轻地上下移液至少10次以彻底混匀。

标准化后的混合文库现在可以进行变性和测序了，有关变性过程的详细说明，请参考相应的测序仪器建议的文库变性和稀释说明书：

· [iSeq 100 System Guide](https://support.illumina.com/downloads/iseq-100-system-guide.html) 中文库稀释章节

· [MiniSeq System Denature and Dilute Libraries Guide](http://support.illumina.com/downloads/miniseq-denature-dilute-libraries-guide.html)

· [MiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide](http://support.illumina.com/downloads/prepare_libraries_for_sequencing_miseq_15039740.html)

· [NextSeq 500/550 System Denature and Dilute Libraries Guide](http://support.illumina.com/downloads/nextseq-500-denaturing-diluting-libraries-15048776.html)

· [HiSeq Systems Denature and Dilute Libraries Guide](http://support.illumina.com/downloads/hiseq-denature-dilute-libraries-guide-15050107.html)

· [cBot System Guide](http://support.illumina.com/downloads/cbot_user_guide_15006165.html) 中HiSeq 3000/4000 文库变性稀释章节

· [NextSeq 1000/2000 Sequencing System Guide](https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/nextseq-1000-2000/documentation.html) 中 NextSeq 2000文库稀释章节

· [NovaSeq System Guide](https://support.illumina.com/downloads/novaseq-6000-system-guide-1000000019358.html) 中 NovaSeq文库变性和稀释章节

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