是否可以混合不同类型的文库并同时进行测序？
不同的文库工作流程可以产生大小、index长度、簇生成效率等方面不同的文库。Illumina建议混合使用相同文库制备工作流程制备的文库并进行测序。此建议适用于在同一运行中（没有单独通道可以加载文库的flow cell）或同一通道中（使用单独通道加载文库的flow cell）混合的库，原因如下：
1. 无法预测的簇密度和对测序质量的负面影响。不同的文库类型可以有不同的片段长度，较短的文库相比较长的文库成簇效率更高。因此，相对于较长的文库，较短的文库将会过度表达（如图1），这有可能导致测序中簇密度过高。如果测序长度超过了较短文库的片段长度，测序质量就会受到负面影响。
文库混合：50%长片段文库+50%短片段文库 ；flow cell上的簇，短片段文库过度表达
图1：同一个文库混合物中含有相同比例的两种不同长度的文库，这会导致较短片段文库的过度表达
2. 簇生成和数据输出不均匀。即使片段大小相似，不同的文库类型会有不同的簇生成效率。这种差异会导致不可预知的簇生成/簇密度，并难以确定使用中的最佳上样浓度。Illumina建议运行单一的文库类型，并根据以下指南为特定的测序仪优化上样浓度：
簇优化概述指南
Clustering Optimization Overview Guide
此外，不同的文库类型有不同的测序深度/覆盖度要求。例如，全基因组文库比扩增子文库需要更多的覆盖度（如图2）。不同文库类型的上样浓度必须进行优化，以实现准确的覆盖度水平，而Illumina并没有为这种优化提供指导。覆盖度计算器可用于确定单一类型文库单次测序的上样数目。
文库混合：50%类型A的文库+50%类型B的文库 ；Flow cell上的簇；读数解读
图2：如果一个文库混合物中含有等量的两种不同类型的文库，即使两种文库的片段长度相同，也可能会导致其中一种类型文库的比例过高，从而影响读数分布和覆盖度。
3. 困难且可能模糊的数据拆分。不同的文库使用不同类型的index（例如，单index或者双index，和不同的index长度）。设置一个运行（或flow cell中每条通道可以单独加载文库）来读取或者单index或者双index，但不能同时检测单index和双index。当单index和双index文库混合时，i5或i7 index同时存在，将设置成单index读长配置（如图3）。
图3：红色的X表示文库混合物中未被读取的index的位置。绿色对勾√表示文库混合物中可以被读取的index的位置。在这个文库混合物中，仅单一的、6个碱基长度的index为可靠的读取结果，因为i7 index会被优先读取，这是为单index文库所作的index读取设置。这样的运行设置会对index拆分产生负面影响。
总之，将不同类型的文库混合在同一测序运行中或同一通道中是不推荐的，需要进行独立的优化和验证。
注意：可以将不同类型的文库加载到支持单独通道加样的flow cell，这样不同类型的文库可以加载到不同的通道上。NovaSeq Xp Workflow、HiSeq Rapid Duo cBot Sample Loading Kit和 HiSeq 2500 High Output modes都支持单独通道加载。然而，即使有独立的flow cell 通道，一次测序运行只能使用一种读长配置。
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