Links

Adapter dimers的形成原因、影响及去除方法

什么是Adapter Dimers?
如果在使用基于芯片的毛细管电泳仪(如BioAnalyzer或Fragment Analyzer),或使用琼脂糖凝胶对测序文库进行质量检测时,在120-170bp处意外出现一个小峰,表明存在Adapter Dimers (图 1).
Adapter Dimers包括全长的Adapter序列,能够结合流动槽(Flow Cell)并成簇,产生测序数据。相比之下,Primer Dimers不包含完整的Adapter序列,不能结合在流动槽上并成簇,所以不能产生测序数据。
引起Adapter Dimers的可能原因有哪些?
  • 起始投入量不足
起始核酸投入量过低会增加Adapter Dimer的形成。为了保证投入量的准确性,建议使用基于荧光检测的方法进行定量,使用工作流程中推荐的投入量范围可最大限度地减少Adapter Dimers出现在最终用于上机的文库中。
  • 起始核酸质量差
对于某些流程,不建议使用片段化或降解的核酸进行建库。文库制备方法中使用降解的核酸进行建库,可能会与试剂盒不兼容,从而形成Adapter Dimers。
  • 磁珠纯化效率低
在使用磁珠进行纯化时,遵循最佳操作时比较关键的,这样可以确保筛选出合适的片段,并保证去除在文库制备期间可能形成的Adapter Dimers。
为什么去除Adapter Dimers如此重要?
Adapter Dimers中包含完整的Adapter序列,所以它们可以成簇和测序。由于Adapter Dimers片段比较小,相对目标片段而言具有更高的成簇效率。相对于目标文库的定量比例,Adapter Dimers可以占据相当大一部分测序数据。此外,Adapter Dimers还会对测序数据质量产生负面影响,甚至可能导致运行提前停止(图2)。
如何去除Adapter Dimers?
如果文库中含有Adapter Dimers,可以使用其他的磁珠(AMPure XP、SPRI或样本纯化磁珠SPB)纯化或胶回收纯化。二轮磁珠纯化会降低文库产量,通常推荐的0.8X-1X的磁珠比例可以去除不想要的Adapter Dimers。
Adapter Dimers是什么样的?
图 1. BioAnalyzer 电泳图显示文库在126bp处有一个Adapter Dimers的峰
图 2. 如果Adapter Dimers在测序期间出现,会在SAV或BaseSpace中的碱基百分比(%Base)图中显示。Adapter Dimers具有以下特征:
  1. 1.
    一个低多样性的区域
  2. 2.
    Index区域
  3. 3.
    另一个低多样性区域
  4. 4.
    当Adapter序列结束并且测到Flow Cell的序列时,"A"碱基增加。这里增加的A碱基也可能是G碱基,取决于使用的测序平台。
根据Adapter Dimer与目标文库片段的比例不同,调用模式也有所不同。也就是说,当Run中出现的Adapter Dimers的比例较低时,可能难以识别出来。
For any feedback or questions regarding this article (Illumina Knowledge Article #7418), contact Illumina Technical Support [email protected].
Last modified 5mo ago
© 2023 Illumina, Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Illumina, Inc. or their respective owners. Trademark information: illumina.com/company/legal.html. Privacy policy: illumina.com/company/legal/privacy.html