# 最小化 TruSeq Stranded Total RNA 文库中rRNA污染的最佳操作
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在TruSeq Stranded Total RNA 文库制备的流程中，首先需要使用Ribo-Zero 探针，从总RNA中去除rRNA。然而有时候，最终的测序数据中仍会发现较多的rRNA序列。本教程阐述了如何确定rRNA残留的根本原因以及如何避免rRNA污染的最佳操作。\
**使用Ribo-Zero 探针去除rRNA 过程 :**
图1a) 生物素标记的Ribo-Zero探针与总RNA混合，并和互补的目标rRNA进行杂交。b) 链霉亲和素包被的磁珠加入到rRNA-Ribo Zero探针的混合溶液中，以捕获生物素标记的探针。 c)， d)磁珠-探针-rRNA复合物被移除，上清液中保留了去除rRNA后的RNA。不过rRNA去除并不是100%有效的，上清液中依旧有少量的rRNA存在。\
**rRNA reads 过剩的可能根源**：
1\. rRNA去除探针和内源rRNA 的结合效果不理想
2\. 磁珠和rRNA去除探针的结合效果不理想
3\. 最后纯化时样本中的磁珠没有被完全去除干净
4\. DNA 污染\
**测序数据中rRNA reads 来源协助故障排查：**
| 测序数据中rRNA的来源 | | |
| ------------ | ----------- | ---------- |
| 来源 | Read 1 比对方向 | Read2 比对方向 |
| 内源rRNA | 反义链 | 正义链 |
| rRNA去除探针 | 正义链 | 反义链 |
**1. rRNA 去除探针和内源rRNA的结合效果不理想**
如果探针与内源rRNA结合效果不理想，或者探针与目标rRNA的互补性较低，去除效率会比较低。当探针被移除时，没有与探针结合的内源rRNA将依旧保留在上清液中。
因为TruSeq Stranded Total RNA 试剂盒是链特异性建库，残留的rRNA reads的链方向将与内源rRNA方向相同： Read 1将比对到反义链上，Read 2将比对到正义链。
如何避免这个问题:
* 充分混匀试剂，使得探针与rRNAs充分接触
* 使用正确的样本起始量 (探针是针对特定量的总RNA进行优化的)
* 正确设置加热模块或热循环仪（PCR仪）温度，以达到最佳的结合效果
* 使用未过期并妥善保存的rRNA去除试剂
* 确保rRNA去除探针适用该物种
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**2. 磁珠结合rRNA去除探针的效果不理想**
如果磁珠不能有效地吸附探针，则样本中内源rRNA及互补rRNA探针的残留量都会比较高，它们将一同进入最终文库。
在这种情况下，残留的rRNA reads的链方向是混合的，具体比例取决于样本中剩余探针的数量。因为内源rRNA和与其互补的rRNA去除探针都进行了测序，所以产生的 Read 1和Read 2 将会比对到两条链上。
如何避免这个问题:
* 遵循磁珠处理的最佳做法：
* 在使用前，磁珠在室温下至少平衡30分钟
* 使用前将磁珠充分混匀
* 将磁珠和样品充分混合
* 根据文库构建准备参考指南中的建议来保存磁珠
* 不要使用冰冻过的rRNA去除磁珠
* 用经过验证的磁力架来吸附磁珠(磁力架的信息可参考指南的消耗品和设备列表)
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**3. 样本中的磁珠没有被完全去除干净**
当磁珠没有被磁力架恰当地吸附时，它们会出现在文库片段质检图谱中高分子量处并以宽峰(见下图)显示（来自TapeStation、Bioanalyzer、Fragment Analyzer或类似仪器)。此时残留rRNA Read的链方向是混合的，具体比例取决于样本中剩余探针的数量。因为内源rRNA和与其互补的rRNA去除探针都进行了测序，所以产生的 Read 1和Read 2 将会比对到两条链上。
如何避免这个问题:
* 使用经过验证的磁力架来吸附磁珠 (磁力架的信息可参考指南的消耗品和设备列表)
* 移除rRNA去除磁珠后，目视检查上清液，确保上清液中没有rRNA去除磁珠
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**4. DNA污染**
如果原始样本RNA中存在DNA，那么污染源DNA同样会被建成文库进行测序。来自DNA文库片段的reads，会显示出混合的方向性。在这种情况下，不仅可以观察到rRNA的链特异性的变化，也可以观察到转录本(外显子) 的链特异性的变化。此外，也可能在数据中发现过多的内含子或基因间区域。
如何避免这个问题:
* 在文库制备前对原始RNA进行DNA酶处理
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**请参考以下故障排除图:**
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