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最小化 TruSeq Stranded Total RNA 文库中rRNA污染的最佳操作

在TruSeq Stranded Total RNA 文库制备的流程中,首先需要使用Ribo-Zero 探针,从总RNA中去除rRNA。然而有时候,最终的测序数据中仍会发现较多的rRNA序列。本教程阐述了如何确定rRNA残留的根本原因以及如何避免rRNA污染的最佳操作。
使用Ribo-Zero 探针去除rRNA 过程 :
图1a) 生物素标记的Ribo-Zero探针与总RNA混合,并和互补的目标rRNA进行杂交。b) 链霉亲和素包被的磁珠加入到rRNA-Ribo Zero探针的混合溶液中,以捕获生物素标记的探针。 c), d)磁珠-探针-rRNA复合物被移除,上清液中保留了去除rRNA后的RNA。不过rRNA去除并不是100%有效的,上清液中依旧有少量的rRNA存在。
rRNA reads 过剩的可能根源
1. rRNA去除探针和内源rRNA 的结合效果不理想
2. 磁珠和rRNA去除探针的结合效果不理想
3. 最后纯化时样本中的磁珠没有被完全去除干净
4. DNA 污染
测序数据中rRNA reads 来源协助故障排查:
测序数据中rRNA的来源
来源
Read 1 比对方向
Read2 比对方向
内源rRNA
反义链
正义链
rRNA去除探针
正义链
反义链
1. rRNA 去除探针和内源rRNA的结合效果不理想
如果探针与内源rRNA结合效果不理想,或者探针与目标rRNA的互补性较低,去除效率会比较低。当探针被移除时,没有与探针结合的内源rRNA将依旧保留在上清液中。
因为TruSeq Stranded Total RNA 试剂盒是链特异性建库,残留的rRNA reads的链方向将与内源rRNA方向相同: Read 1将比对到反义链上,Read 2将比对到正义链。
如何避免这个问题:
  • 充分混匀试剂,使得探针与rRNAs充分接触
  • 使用正确的样本起始量 (探针是针对特定量的总RNA进行优化的)
  • 正确设置加热模块或热循环仪(PCR仪)温度,以达到最佳的结合效果
  • 使用未过期并妥善保存的rRNA去除试剂
  • 确保rRNA去除探针适用该物种
2. 磁珠结合rRNA去除探针的效果不理想
如果磁珠不能有效地吸附探针,则样本中内源rRNA及互补rRNA探针的残留量都会比较高,它们将一同进入最终文库。
在这种情况下,残留的rRNA reads的链方向是混合的,具体比例取决于样本中剩余探针的数量。因为内源rRNA和与其互补的rRNA去除探针都进行了测序,所以产生的 Read 1和Read 2 将会比对到两条链上。
如何避免这个问题:
  • 遵循磁珠处理的最佳做法:
  • 在使用前,磁珠在室温下至少平衡30分钟
  • 使用前将磁珠充分混匀
  • 将磁珠和样品充分混合
3. 样本中的磁珠没有被完全去除干净
当磁珠没有被磁力架恰当地吸附时,它们会出现在文库片段质检图谱中高分子量处并以宽峰(见下图)显示(来自TapeStation、Bioanalyzer、Fragment Analyzer或类似仪器)。此时残留rRNA Read的链方向是混合的,具体比例取决于样本中剩余探针的数量。因为内源rRNA和与其互补的rRNA去除探针都进行了测序,所以产生的 Read 1和Read 2 将会比对到两条链上。
如何避免这个问题:
  • 使用经过验证的磁力架来吸附磁珠 (磁力架的信息可参考指南的消耗品和设备列表)
  • 移除rRNA去除磁珠后,目视检查上清液,确保上清液中没有rRNA去除磁珠
4. DNA污染
如果原始样本RNA中存在DNA,那么污染源DNA同样会被建成文库进行测序。来自DNA文库片段的reads,会显示出混合的方向性。在这种情况下,不仅可以观察到rRNA的链特异性的变化,也可以观察到转录本(外显子) 的链特异性的变化。此外,也可能在数据中发现过多的内含子或基因间区域。
如何避免这个问题:
  • 在文库制备前对原始RNA进行DNA酶处理
请参考以下故障排除图:
For any feedback or questions regarding this article (Illumina Knowledge Article #7416), contact Illumina Technical Support [email protected].
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