MiSeq上开始一个测序反应的时候，遇到Flow Rate检测失败，该如何处理?

在MiSeq上开始一个测序反应的时候，如果Pre-Run Check的过程中出现Flow Rate检测失败（Unable to Measure Flow Rate）的情况（图1），可以参照以下步骤来进行处理。其中步骤3和步骤4可以在重新做Pre-Run Check之前同时进行。

图1. Pre-Run Check中出现Flow Rate检测失败（Unable to Measure Flow Rate）报错

1. 在图1所示的Volume一栏输入500，然后点击Pump按钮，仪器吸取PR2之后，Restart Check按钮会变蓝色，点击这个按钮重新尝试进行Flow Rate检测；

2. 如果成功，可以在新的页面中点击Start Run按钮开始测序，如果还是提示Unable to Measure Flow Rate，重复步骤1，如果成功，可以点击新的页面中Start Run按钮开始测序；如果再次失败，点击Exit，退出Pre-Run Check然后按照下面的步骤继续进行尝试；

3. 检查Flow Cell特别是垫圈位置是否有损坏或者异常：

• 打开MiSeq Flow Cell的舱门，取出Flow Cell；

• 确认Flow Cell的垫圈是否和下面左图（Normal: Gasket Flush）所示一样平整：

图2. Flow Cell垫圈检查

• 如果垫圈有突起或者扭曲，请不要使用这张Flow Cell，如果Flow Cell在保质期内，请联系illumina 技术支持。请将有异常的Flow Cell的批次信息以及序列号（Serial Number）等信息提供给技术支持，并附上一张照片说明垫圈的异常。如果您实验室有其它测序试剂盒，请另外取出一张Flow Cell重新做Pre-Run Check；

• 如果垫圈是平整的，擦拭一下Flow Cell，将Flow Cell放回Flow Cell 载台重新做一遍Pre-Run Check。

4. 清洁并重新放置Flow Cell：

• 用实验室级别的水轻轻冲洗Flow Cell，将玻璃表面以及塑料表面的盐冲洗掉；

• 用无尘纸将Flow Cell表面擦干，留意垫圈上的试剂出入口，轻轻擦干垫圈以及邻近的玻璃表面；

• 用沾了酒精的无尘纸擦拭Flow Cell玻璃表面，注意不要碰到垫圈表面；

• 检查Flow Cell载台表面是否有异物或者盐，用酒精湿巾或者沾了酒精的无尘纸擦拭Flow Cell载台表面；

• 将Flow Cell放回到Flow Cell载台，确保放置到位；

• 在MiSeq 控制软件（ MiSeq Control Software）中再次进行Pre-Run Check。

5. 如果Flow Rate检测再次失败，点击Exit，退出Pre-Run Check，重启测序仪器：

• 通过MiSeq控制软件关闭测序仪，然后将背面的开关按钮按下；

• 将仪器保持关机状态至少2分钟，确保仪器所有组件充分关闭；

• 按下测序仪背面的开关按钮，开机；

• 在MiSeq控制软件（MiSeq Control Software）中，再做一次Pre-Run Check。

6. 如果Flow Rate检测再次失败，点击Exit，退出Pre-Run Check，从另一个试剂盒中换一张Flow Cell再做尝试：

• 打开MiSeq的Flow Cell舱门，取出Flow Cell；

• 参照步骤2，清洁Flow Cell；

• 将新的Flow Cell放回到Flow Cell载台，确保放置到位；

• 在MiSeq控制软件（MiSeq Control Software）中，重新开始设置Run；

• 重新做一次Pre-Run Check；

• 如果Pre-Run Check通过，记录之前那一张Flow Cell的批次信息，发邮件反馈给illumina 技术支持。

7. 如果换了新的Flow Cell，问题依然没有解决，请将尝试过的Flow Cell放回原包装中，并置于4度冰箱保存，然后联系技术支持获取帮助。

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