如何排查Miseq平台上的第一个循环报错的原因？

Miseq平台在第一个循环拍照时发生报错通常表明簇信号强度不够，仪器不能找到最佳的聚焦平面。这可能是由于簇密度过高、过低或簇生成失败造成的。

可能的报错信息包括：

Best focus not found
Best focus is too near the edge of range
No usable signal found, it is possible clustering has failed
Through-focus peak did not exceed SNR threshold
Z Motor attempt to move outside soft limits
New in MiSeq Control Software (MCS) v4.0: ThroughFocusScan CoarseFocus failed to find focus, and there is no fallback position.

第一个循环报错可能由文库、运行设置、仪器或试剂问题引起。

可能的仪器原因包括：

参与簇生成和第一个碱基化学反应试剂的液流问题
流动槽温控问题
光学系统问题（这种情况非常少）

可能的文库和试剂原因包括：

使用了过期或者储存条件不当的试剂
文库设计或者文库质量/定量问题
由于文库设计问题导致Read1引物杂交不好
使用了不合适的引物
簇密度过高或者过低
NaOH的pH值
清洗槽的污染

如果已明确是引物问题，而且机器可以联网，请直接和techsupport联系进行问题排查。

如果聚焦失败发生在测序过程中 (例如index的第一个循环或者Read1或Read4的中途) ，请搜索illumina knowledge中的技术文档“Troubleshooting best focus errors occurring mid-run on the MiSeq, Troubleshooting Z motor errors occurring mid-run, and Troubleshooting No Intensity for Index Read on MiSeq“进行问题排查。

排查第一个循环报错原因

首先可以按照MiSeq System Guide对仪器进行系统检查，确保仪器的流路、温度以及机械移动系统正常运行：

对仪器进行post run wash（测序后清洗）
按照使用手册，重启机器
去Manage Instrument（管理仪器）界面，点击System Check（系统检查）
选择所有的机械移动系统测试，润洗试剂流路，温度梯度以及流路测试。

当系统检查完成，点击屏幕左下方的Show Details（展开细节）按钮，得到检查结果的完整信息。如果是PR2以外的任何流路测试或者其它测试失败，请发邮件到chinasupport@illumina.com去获得更多技术支持。

如果系统检查未显示测试失败，则要考虑报错可能是由文库或者试剂问题导致的。我们需要分析以下常见问题：

检查试剂盒的有效日期以及正确储存条件。
确保文库设计适合在Illumina平台测序。
利用Illumina推荐的方法，检查文库质量和浓度。
确保自定义引物适合Miseq 平台65℃的退火温度
确保自定义引物加入到试剂盒正确的孔中（如果加入到已有引物的试剂孔中，sample sheet不需要修改，如果加入到自定义引物的试剂孔中，则sample sheet需要选择自定义引物）
NaOH是新鲜稀释的且pH值大于12.5