如何排查MiSeq平台上的第一个循环报错的原因？

MiSeq平台在第一个循环拍照时发生报错通常表明簇信号强度不够，仪器不能找到最佳的聚焦平面。这可能是由于簇密度过高、过低或簇生成失败造成的。

可能的报错信息包括：

Best focus not found
Best focus is too near the edge of range
No usable signal found, it is possible clustering has failed
Through-focus peak did not exceed SNR threshold
Z Motor attempt to move outside soft limits
New in MiSeq Control Software (MCS) v4.0: ThroughFocusScan CoarseFocus failed to find focus, and there is no fallback position.

第一个循环报错可能由文库、运行设置、仪器或试剂问题引起。

可能的仪器原因包括：

可能的文库和试剂原因包括：

第一个循环的错误表明仪器在第一个循环未能识别到足够信号，无法计算出flow cell上的适当焦点位置。MiSeq测序仪在首轮成像后出现的错误可能意味着簇强度不足，导致仪器无法找到最佳聚焦平面。

如果聚焦失败发生在测序过程中 (例如index的第一个循环或者Read1或Read4的中途) ，请搜索illumina knowledge Bases中的技术文档Troubleshooting best focus errors occurring mid-run on the MiSeq, Troubleshooting Z motor errors occurring mid-run 和 Troubleshooting No Intensity for Index Read on MiSeq进行问题排查。

故障排查步骤：

首先可以按照MiSeq System Guide对仪器进行系统检查，确保仪器的流路、温度以及机械移动系统正常运行：

当系统检查完成，点击屏幕左下方的Show Details（展开细节）按钮，得到检查结果的完整信息。如果是PR2以外的任何液量测试或者其它测试失败，请发邮件到[email protected]去获得更多技术支持。

如果系统检查通过，则要考虑报错可能是由文库或者试剂问题导致的。我们需要分析以下常见问题：

检查试剂盒的有效日期以及正确储存条件。
确保文库设计适合在Illumina平台测序。
利用Illumina推荐的方法，检查文库质量和浓度。
确保自定义引物适合MiSeq 测序平台
确保自定义引物加入到试剂夹盒正确的孔位中（如果加入到已有引物的试剂孔中，sample sheet不需要修改，如果加入到自定义引物的试剂孔中，则sample sheet需要选择自定义引物）
NaOH是新鲜稀释的且pH值大于12.5