如何排查Miseq平台上的第一个循环报错的原因？

Miseq平台在第一个循环拍照时发生报错通常表明簇信号强度不够，仪器不能找到最佳的聚焦平面。这可能是由于簇密度过高、过低或簇生成失败造成的。

可能的报错信息包括：

• Best focus not found

• Best focus is too near the edge of range

• No usable signal found, it is possible clustering has failed

• Through-focus peak did not exceed SNR threshold

• Z Motor attempt to move outside soft limits

• New in MiSeq Control Software (MCS) v4.0: ThroughFocusScan CoarseFocus failed to find focus, and there is no fallback position.

第一个循环报错可能由文库、运行设置、仪器或试剂问题引起。

可能的仪器原因包括：

• 参与簇生成和第一个碱基化学反应试剂的液流问题

• 流动槽温控问题

• 光学系统问题（这种情况非常少）

可能的文库和试剂原因包括：

• 使用了过期或者储存条件不当的试剂

• 文库设计或者文库质量/定量问题

• 由于文库设计问题导致Read1引物杂交不好

• 使用了不合适的引物

• 簇密度过高或者过低

• NaOH的pH值

• 清洗槽的污染

如果已明确是引物问题，而且机器可以联网，请直接和techsupport联系进行问题排查。

如果聚焦失败发生在测序过程中 (例如index的第一个循环或者Read1或Read4的中途) ，请搜索illumina knowledge中的技术文档“Troubleshooting best focus errors occurring mid-run on the MiSeq, Troubleshooting Z motor errors occurring mid-run, and Troubleshooting No Intensity for Index Read on MiSeq“进行问题排查。

排查第一个循环报错原因

首先可以按照MiSeq System Guide对仪器进行系统检查，确保仪器的流路、温度以及机械移动系统正常运行：

1. 对仪器进行post run wash（测序后清洗）

2. 按照使用手册，重启机器

3. 去Manage Instrument（管理仪器）界面，点击System Check（系统检查）

4. 选择所有的机械移动系统测试，润洗试剂流路，温度梯度以及流路测试。

当系统检查完成，点击屏幕左下方的Show Details（展开细节）按钮，得到检查结果的完整信息。如果是PR2以外的任何流路测试或者其它测试失败，请发邮件到[e-mail]去获得更多技术支持。

如果系统检查未显示测试失败，则要考虑报错可能是由文库或者试剂问题导致的。我们需要分析以下常见问题：

• 检查试剂盒的有效日期以及正确储存条件。

• 确保文库设计适合在Illumina平台测序。

• 利用Illumina推荐的方法，检查文库质量和浓度。

• 确保自定义引物适合Miseq 平台65℃的退火温度

• 确保自定义引物加入到试剂盒正确的孔中（如果加入到已有引物的试剂孔中，sample sheet不需要修改，如果加入到自定义引物的试剂孔中，则sample sheet需要选择自定义引物）

• NaOH是新鲜稀释的且pH值大于12.5

如果文库或试剂没有明显问题，在文库中掺入20% PhiX重新测序。PhiX可以作为下一次测序簇生成的阳性对照，进而判断之前的错误是否是由文库问题导致的。

如果下一次测序第一个循环仍旧发生No Usable Signal和Best Focus报错，可以发邮件到Illumina技术支持邮箱[e-mail]获得更多技术支持。

更多资源链接:

MiSeq System Custom Primers Guide

Spiking custom primers into the Illumina sequencing primers

MiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide

更多信息，请搜索 Knowledge Base中以下文档:

Spiking custom primers into the Illumina sequencing primers

How to achieve more consistent cluster density on Illumina sequencing platforms

System checks for Illumina sequencing platforms

How To Power Cycle the MiSeq Video

Troubleshooting best focus errors occurring mid-run on the MiSeq

Troubleshooting Z motor errors occurring mid-run on the MiSeq

Troubleshooting No Intensity for Index Read on MiSeq

Best Focus and No Usable Signal errors on the MiSeq



For any feedback or questions regarding this article (Illumina Knowledge Article #7340), contact Illumina Technical Support [e-mail].