FASTQ文件解读

Illumina测序技术使用 簇生成和边合成边测序（SBS）化学技术对流动槽（flow cell）上数百万或数十亿簇（cluster）进行测序，具体簇的数目取决于测序平台。 在边合成边测序化学过程中，仪器上的实时分析（RTA）软件对每个簇的每个循环进行碱基检出和存储。 RTA以单个读取碱基（base call，或称BCL）文件的形式存储碱基检出数据。 测序完成后，必须将BCL文件中的测定的碱基转换为序列数据。 此过程称为BCL到FASTQ的转换。

FASTQ文件是一个文本文件，其中包含通过流动槽（flow cell）上质控参数的簇（cluster）的测序数据（有关簇的质控参数，请参阅本公告的“其他信息”部分）。如果样本是multiplexed，则FASTQ文件生成的第一步是demultiplexing。 demultiplexing根据簇的index序列将簇分配给样本。 demultiplexing后，将每个样本的组合序列写入FASTQ文件。 如果未对样品进行multiplex，则不会发生demultiplexing，并且对于每个流动槽每个通道（Lane）中的所有簇都分配给一个样品。

对于单端测序的运行，将为每个流动槽上每条通道的每个样品创建一个Read 1（R1）FASTQ文件。 对于双端测序的运行，将为每个流动槽上每条通道的每个样品各创建一个R1和一个Read 2（R2）FASTQ文件。 FASTQ文件是使用扩展名*.fastq.gz压缩和创建的。

FASTQ文件是什么样的？

对于每个通过质控参数的簇，一个序列被写入相应样本的R1 FASTQ文件，而对于双端测序运行，另外一个序列也被写入该样本的R2 FASTQ文件。 FASTQ文件中的每个条目包含4行：

1. 序列标识符，其中包含有关测序运行和簇的信息。 该行的具体内容会因使用的BCL到FASTQ转换软件而不同。

2. 序列（碱基信号； A，C，T，G和N）。

3. 分隔符，只是一个加号（+）。

4. 读取碱基的质量值。T这些是Phred +33编码的，使用 ASCII字符表示数字质量值。

这是R1 FASTQ文件中单个记录条目的示例：

有关FASTQ 格式的更多详细信息，请参见此处。

如何查看FASTQ文件

FASTQ文件最多可以包含数百万个条目，大小可以为数兆字节或千兆字节，这常常使它们太大而无法在常规文本编辑器中打开。 通常情况下，并没有必要查看FASTQ文件，因为它们是做下游分析（例如与参考基因组序列比对或从头组装）的中间文件。

如果出于故障排除目的或兴趣需要查看FASTQ文件时，则需要在可以处理非常大文件的文本编辑器打开文件，或者使用可以通过命令行查看大文件的Unix或Linux系统。

如何生成FASTQ文件

FASTQ文件生成是MiSeq上MiSeq Reporter和MiniSeq上的Local Run Manager进行所有分析工作流程的第一步。 分析完成后，FASTQ文件位于MiSeq上的< run folder > \ Data \ Intensities \ BaseCalls和MiniSeq上的< run folder > \ Alignment _＃\ <子文件夹> \ Fastq中。

对于上传到BaseSpace基因云计算平台的所有运行，测序数据上传结束后会自动生成FASTQ文件，并且FASTQ文件可以用作BaseSpace基因云计算平台上各种分析apps的输入文件。 在BaseSpace基因云计算平台上，您可以在与您的运行关联的项目（projects）中找到FASTQ文件。

bcl2fastq转换软件可用于将目前所有Illumina测序系统上产生的数据转换成FASTQ文件。

有关在FASTQ文件生成过程中使用的不同设置的详细信息，请参阅下面的软件用户指南。

• MiSeq Reporter

• Local Run Manager

• bcl2fastq

• BCL Convert

其他信息

• 有关簇通过质控参数的说明和要求，请参阅MiSeq: Imaging and Base Calling 课程的1.5.8节。

• 有关NovaSeq，NextSeq 500/550和MiniSeq系统上的碱基检出的更多信息，请参阅2-Channel SBS Technology。

• 有关在MiSeq和HiSeq系统上进行碱基检出的更多信息，请参见Illumina Sequencing Technology。

For any feedback or questions regarding this article (Illumina Knowledge Article #7412), contact Illumina Technical Support [e-mail].